荧光滤光片选择要点

荧光成为生命科学的重要研究工具不是偶然的。因为激发光和发射光波长不一样，因此可以将漫散射光和特异性荧光分开，只成像特异性荧光区域，从而实现特异性分子级功能研究。
将激发光/漫散射光和特异性荧光区分开的工具就是滤光片。滤光片广泛存在于使用荧光的科研仪器中，比如荧光显微镜、流式细胞仪、RT-PCR等。在显微镜中，滤光片通常存在于一个小方盒子中，如果我们打开这个盒子，会发现里面有三个不同的滤光片，其中两个是圆的，一个是长方形的。两个圆形的，分别是激发光滤光片和发射光滤光片，那个长方形的就是较重要的二向分色镜片。
之所以说二向分色镜片较重要，是因为将激发光/漫散射光和荧光发射光区分开就是二向分镜片的功劳。
激发光滤光片负责筛选合适激发光波长。比如将白光激发光筛选为蓝光，用于激发GFP等荧光素。如果用的是单波长的LED或者激光，激发光滤光片就不是必须的了。
发射光滤光片负责筛选需要的荧光发射光。当一个波长的激发光，能够激发不同发射光时，这个滤光片就可以将不同的发射光区分，比如同样可以用蓝光激发的FITC和PE。另外，因为很多生物学组织都有自发荧光，且自发荧光多处于红光区域，利用发射光滤光片可以过滤掉自发荧光干扰。如果一个样本只有一种荧光，而且没有自发荧光干扰，这个滤光片也是可以省略的。
二向色镜的作用是区分激发光和发射光，这个应该是必须的了。但也有仪器是可选的。绝大多数光路设计，采用的是二向分色镜，搭建方便，调节也方便。
那么问题来了，我们应该如何去选择适合我们所需的滤光片呢？
首先，需要确定所使用荧光素的激发和发射光谱。我们可以通过几个常用的网站，查询荧光素的光谱。比如Thermo旗下的Invitrogen/Molecular Probe网站，有比较好用的荧光光谱查看器，如果是一些流式细胞分析用荧光素，可能需要到对应的公司网站查询。
得到荧光光谱信息后，我们就可以针对性的选择所需的滤光片了。
我们可以将滤光片光谱与荧光素光谱重叠在一起，分析滤光片是否合适。
当然，在选择滤光片时，还需要考虑激光光源的光谱，特别是汞灯、金属卤素灯和白光LED，避免选择光源发射较弱的区域。
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